Qiagen試劑盒提取總RNA的操作過(guò)程：
1、稱取新鮮葉組織樣品100 mg，液氮速凍。
2、在預(yù)冷的研缽中研磨成細(xì)粉，轉(zhuǎn)移到2 ml離心管中。注意研磨不*則會(huì)造成嚴(yán)重產(chǎn)量降低。
3、待液氮揮發(fā)(但不能解凍)后，加入450 ml提取緩沖液RLT，渦旋混勻，并在56℃溫育1~3 min。注意：在RLT臨用前加入1/100體積的14.5 M β-巰基乙醇，加后保存時(shí)間不超過(guò)1個(gè)月，RLT溶液應(yīng)在1個(gè)月內(nèi)使用。對(duì)于高淀粉含量的材料，可將溫度提高到60℃以上防止淀粉結(jié)塊。
4、將裂解液加到離心柱(淺紫色柱)上，下接一個(gè)2 ml收集管，zui大轉(zhuǎn)速離心2 min。如果將裂解液粘稠，可切去吸頭頂端，用大口吸頭吸取。裂解液通過(guò)柱子時(shí)被均質(zhì)化，大部分組織碎片都被截留在柱子表面，只有少部分通過(guò)柱子形成沉淀，因此，應(yīng)小心吸取上清液，轉(zhuǎn)移到另一新離心管，不要吸細(xì)胞碎片殘?jiān)恋怼?/p>
5、加入0.5倍體積(225 µL)96~99.99%乙醇，吹打混合均勻。如果裂解液有損失，則相應(yīng)減少乙醇用量。加入乙醇后，可能會(huì)出現(xiàn)沉淀，但對(duì)提取無(wú)影響。
6、將混合液全部(包括沉淀675 µL)轉(zhuǎn)移到吸附RNA的離心柱(粉紅色柱)，下接一個(gè)2 ml收集管，大于8000 g或10000 r/min離心15 sec。如果混合液體積超過(guò)700 µL，每次只加700 µL到離心柱上，按上述條件離心。棄去管內(nèi)液體，重復(fù)使用收集管。
7、加入700 µL洗脫液，大于8000 g或10000 r/min離心25 sec，棄去收集管。
8、將離心柱轉(zhuǎn)移到一新的2 ml收集管上，加入500 µL RPE液，大于8000 g或10000 r/min離心15 sec。棄去管內(nèi)液體，重復(fù)使用收集管。注意：Qiagen試劑盒提供濃縮的PRE洗脫液，所心使用前必須加入4倍體積的96~99.99%乙醇，成為工作液。
9、加入500 µL RPE液到離心柱上，zui大轉(zhuǎn)速離心2 min，干燥離心柱，棄去收集管。殘留乙醇會(huì)干擾隨后的反應(yīng)，這次離心要保證無(wú)乙醇?xì)埩?。若有乙醇?xì)埩?，以zui大轉(zhuǎn)速離心1 min。
10、把離心柱連接到一新的1.5 ml收集管上，加入20~30 µL 無(wú)RNase水，大于8000 g或10000 r/min離心1 min，洗脫RNA。若RNA產(chǎn)量在20 μg以上，用30~50 µL無(wú)RNase水再洗脫一次。RNA樣品存于-20℃或-80℃冰箱。
11、分光光度計(jì)測(cè)定RNA。開(kāi)啟紫外分光光度計(jì)，預(yù)熱30 min。用DEPC處理水校正零點(diǎn)。用DEPC處理水稀釋RNA樣品30~50倍，將稀釋液轉(zhuǎn)移到比色杯中。讀取230、260、280、310 nm的OD值。計(jì)算出樣品濃度和OD比值。OD260/ OD280比值應(yīng)為1.7~2.1，低于1.7，說(shuō)明有蛋白質(zhì)或酚污染;OD260/ OD230比值應(yīng)大于2，低于此值，說(shuō)明有糖、鹽、胍等小分子污染。
12、瓊脂糖凝膠甲醛變性電泳。首先制備凝膠(1.2%)。稱取1.2 g瓊脂糖，加72 ml DEPC處理的水，加熱溶化。冷卻至60℃，在通風(fēng)櫥內(nèi)加入10×凝膠緩沖液10 ml，甲醛(37%)18 ml，混勻后倒膠。然后制備樣品。在離心管中，將RNA樣品與5×變性上樣緩沖液按4:1比例混勻。65℃溫育5~10 min，迅速在冰上冷卻5 min，瞬時(shí)離心數(shù)秒。上樣前凝膠須預(yù)電泳5 min，隨后將樣品加入上樣孔。以5 V/cm電壓電泳1.5~2 hr。待溴酚藍(lán)遷移至凝膠長(zhǎng)度的2/3~4/5處結(jié)束電泳。將凝膠置于溴化乙錠溶液(0.5 µg/mL，用0.1 mol/L乙酸胺配制)中當(dāng)色約30 min。紫外燈下觀察結(jié)果。
以上是Qiagen試劑盒提取總RNA的全部過(guò)程，如果您還有什么疑問(wèn)，咨詢北京諾博萊德科技有限公司。
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